Cryo-electron microscopy (cryo-EM)는 이제 거대한 단백질 복합체의 고해상도 구조를 결정하는 첫 번째 선택입니다. 탄소 필름으로 덮인 2 차원 구멍 배열을 가진 격자는 일반적으로 cryo-EM에 사용됩니다. 반자동 플런저를 사용할 수 있지만 적절한 그리드 시편을 얻기 위해서는 여전히 시행 착오가 필요합니다. 여기, cryo-EM 그리드에서 액체 양의 실시간 측정을 사용하여 얇은 얼음 표본을 얻는 새로운 방법을 소개합니다. cryo-EM에 대한 그리드는 레이저 광을 강하게 회절 시켰으며, 각 스폿의 회절 강도는 실시간으로 측정 가능했다. 측정 된 회절 패턴은 주위의 액체의 곡률로 인해 구멍 내의 액체의 상태를 나타냈다. 회절 패턴을 사용하여, cryo-EM의 그리드를 동결시키기위한 최적의 시점을 실시간으로 얻었다. 이 개발은 연구원들이 제한된 cryo-EM 기기 접근 자원을 사용하여 고해상도 단백질 구조를 신속하게 결정하는 데 도움이 될 것입니다.
회절 패턴은 규칙에 대한 푸리에 변환 된 정보를 제공합니다. EM 그리드를 준비 할 때 실시간으로 그리드의 액체 양을 아는 것이 도움이됩니다. 고배율에서의 하이 엔드 광 현미경은 이러한 정보를 제공 할 수 있지만, 고배율에서는 작은 영역 만이 실시간으로 시각화 될 수 있기 때문에 전체 그리드의 상태를 결정하는 것은 불가능할 것이다. 대조적으로, 회절 이미지는 각각의 회절 스폿이 저렴한 레이저 소스를 사용하는 모든 홀로부터의 광의 합산이기 때문에 비용 효율적인 방식으로 그리드 상태의 전체적인 특징을 보여준다. 따라서, 회절 방법은 그리드 상태에 대한 더 나은 정보를 제공 할 수있어, 연구원들이 저렴한 가격으로 각 cryo-EM 실험에 적합한 조건을 결정할 수 있습니다.
회절 패턴의 강도와 모양에 영향을 미치는 많은 요소가 있습니다. 액체 층이 스크린까지의 거리에 비해 매우 얇고 650 nm에서 레이저 광을 고도로 흡수하지 않기 때문에, 홀 내의 액체 깊이는 레이저 광의 침투 효율을 감소시키지 않는다고 가정하는 것이 합리적이다. 그러나 액체 표면에서 빔의 입사에서 후방 산란을 고려해야합니다. 구멍의 액체 층이 매우 얇아도 빛의 후방 산란은 레이저의 침투 속도를 감소시킵니다. 액체 층이 완전히 건조되어 제거되면 침투 효율은 완전히 회복 될 것이다.
또 다른 중요한 요소는 빛이 오목하고 볼록한 모양에 의해 다르게 굴절되기 때문에 액체 층에 의한 빛의 굴절입니다. 격자 구멍에서 액체의 곡률은 액체의 양과 표면 장력에 따라 변경됩니다. 액체 곡률이 적절하게 볼록한 경우, 회절 빔은 스크린에 집중되어 회절 강도가 약간 증가 할 것이다. 액체 곡률이 오목한 경우, 회절 광이 스크린 또는 광 센서에서 분기되어 회절 강도가 감소 된 회절 스폿이 생성됩니다. 실제로, 7 초 내에 약간 상승 된 회절 강도가 관찰되었으며, 이는 구멍에서 액체의 볼록한 곡률과 관련 될 수있다 (도 4a; c 및 6c). 그 후, 여과지가 샘플 액체를 흡수함에 따라 회절 강도가 감소하였고 (도 4; e), 이는도 6e에 도시 된 바와 같이 구멍에서 액체의 오목한 형태와 관련 될 것이다. 여과지가 그리드로부터 더 많은 액체를 흡수함에 따라, 구멍의 오목한 곡률에 의해 형성된 수막이 파열되어 회절 강도를 증가시킨다 (도 6F). 이 연구에서, 최소 회절 강도와 증가 강도 영역 사이의 시간은 그 시점에서 그리드를 액체 에탄으로 절입 할 수 있도록 적절하게 식별 할 수 있었다.
이러한 예비 데이터를 바탕으로 단백질 샘플이 포함 된 그리드를 준비하여 구조적 결정을위한 이미지를 수집합니다. 회절 방법을 사용하여 그리드 상태를 실시간으로 모니터링하면 재현 가능한 동결을위한 최적의 조건을 신속하게 결정할 수있어 EM 시간이 줄어 듭니다.